細(xì)胞光毒性試驗材料與試劑

（一）光源類型

選擇合適的光源必須符合的標(biāo)準(zhǔn)包括：光源發(fā)射的光波長能被受試物吸收（吸收光譜），光的劑量（在一個合理的暴露時間內(nèi)能達(dá)到的劑量）能滿足已知光毒性化學(xué)物質(zhì)的檢測。此外的波長和劑量不能有損于試驗系統(tǒng)，如（紅外區(qū)域）熱量散發(fā)或類似UVB波長的高細(xì)胞毒性的干擾，因此光源要求能夠穩(wěn)定地釋放UVA和可見光波長，推薦使用LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀。

由于的太陽光模擬器都發(fā)射出相當(dāng)數(shù)量的UVB，應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪^濾使UVB＜0.1J/cm2。透過96孔組織培養(yǎng)板蓋的光強(qiáng)度建議為1.7mW/cm2光強(qiáng)度（即5J/cm2）劑量。

（二）細(xì)胞株

選用永生化小鼠成纖維細(xì)胞系—Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞。要求細(xì)胞來源必須是具有公信力的機(jī)構(gòu)且能確保細(xì)胞品質(zhì)穩(wěn)定。

由于細(xì)胞對UVA的敏感性隨傳代數(shù)的增加可能增高，建議用于試驗的Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞傳代次數(shù)好少于100次。

測試單位若自行培養(yǎng)細(xì)胞株，則須定期檢測細(xì)胞株對UV光的敏感性，并確保無支原體污染。

（三）培養(yǎng)基

采用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/L）、抗生素（青霉素和鏈霉素，濃度分別為100IU和100μg/mL），在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2條件下培養(yǎng)。

（四）溶劑的選擇

在測定前，應(yīng)首先評價受試物的溶解度，以選擇佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細(xì)胞活性。

能溶于水且濃度達(dá)1000μg/mL的受試物可溶于預(yù)先加溫（37℃）和滅菌的磷酸鹽緩沖液（EBSS或PBS）。水中溶解度有限的受試物（＜1000μg/mL）可用二甲基亞砜（DMSO）或乙醇（ETOH）等溶劑溶解。使用DMSO或ETOH作為溶劑時，其終濃度不得超過總體積的1%（v/v），陰性對照組和受試物組溶劑的體積比例應(yīng)相同。

（五）受試物的配制

受試物必須在使用前新鮮配制。建議的化學(xué)物質(zhì)操作和細(xì)胞處理初期都應(yīng)避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進(jìn)行。

每次實驗應(yīng)設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照。

（六）受試物劑量的設(shè)置

需通過預(yù)實驗確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數(shù)稀釋因子（如 ＝3.16）稀釋成8個濃度，相關(guān)濃度范圍應(yīng)包括從大細(xì)胞毒性至幾乎無細(xì)胞毒性濃度（細(xì)胞存活率在20%—的范圍）。

如果預(yù)實驗結(jié)果表明在濃度等于1000μg/mL時仍未出現(xiàn)細(xì)胞毒性，則建議高濃度為1000μg/mL；若出現(xiàn)細(xì)胞毒性的濃度低于1000μg/mL時，有細(xì)胞毒性的濃度少于三種，則需要進(jìn)行重復(fù)試驗或使用更小的稀釋因子，直至出現(xiàn)有細(xì)胞毒性的濃度至少三種。如果根據(jù)受試物的溶解度，高濃度不能達(dá)到1000μg/mL，則以大溶解度時的濃度作為高濃度，避免受試物在任何濃度出現(xiàn)沉淀。

如果在無光照條件下(-Irr)受試物在高濃度時仍然不具有細(xì)胞毒性，而在有光照條件下(+Irr)出現(xiàn)強(qiáng)烈細(xì)胞毒性，則在-Irr試驗和+Irr試驗中可采用不同的試驗濃度。

（七）中性紅（Neutral Red，NR）

化學(xué)名為3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪鹽酸鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride)，CAS編號:553-24-2；或藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號：100460。

（八）中性紅溶液

1．中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料，溶于100mL蒸餾水（室溫條件下可保存2個月）

2．中性紅使用液。在79mL DMEM培養(yǎng)液中加入1mL中性紅原液，即為使用液。中性紅終濃度為50μg/mL。

（九）中性紅解吸附溶液

將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（現(xiàn)用現(xiàn)配，儲存不超過1小時）。